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新技术——轻松拿捏干细胞培养

提供者:上海威正翔禹生物科技有限公司   发布时间:2022/7/18 10:52:40  阅读次数:13次   进入该公司店铺

干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞,能够产生至少一种类型的,高度分化的子代细胞[1]。干细胞被认为可以提供一种理想的生物学平台, 用于多方面的科学研究与临床应用, 如药物筛选平台的建立,细胞发育与分化的分子调节机制研究,基因靶向敲除动物模型的构建,组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立,细胞治疗及再生医学等[2]

 

干细胞研究离不开干细胞的培养。合格的干细胞培养的过程,包括促进其分裂增殖和维持其未分化状态。基于以上两点要求,目前主流的标准培养方法为饲养层培养法:即在有丝分裂失活的饲养层细胞 (FEEDER) 培养干细胞。培养体系一般为高糖DMEM,添加适量的胎牛血清 (FCS) 及白血病抑制因子 (LIF)L-谷氨酰胺等添加剂。另外,为了避免外源性物质的干扰(如血清,病原等成分)[3],又尝试及建立了其他培养基, 包括条件培养基 (CM) ,无饲养层,无血清,血清替代物 (SR) 非条件培养基等。其中无血清培养基中添加了更多珍贵的细胞因子,而血清替代物培养基则采用人工/半人工合成分子替代物的形式,来替代血清,成本相较于普通胎牛血清完全培养基而言,高出不少。

 

一,饲养层培养法

目前认为,饲养层能够提供的干细胞接触所必须的复杂蛋白分子。自1981EVANS[4]用饲养层成功培养了mESC起,饲养层培养法便开始不断发展。实验过程,主要分为以下三步:准备饲养层细胞,饲养单层制备,接种干细胞培养。

 

饲养层培养法却存在着不可避免的缺点:

1, 饲养层细胞生命期有限,不能在体外长期传代。在体外传代时间太长,其产生促增殖因子和抑制分化因子的能力会减弱甚至丧失。

2, MEF细胞的染色体干扰:饲养层细胞会影响干细胞遗传物质。  

3, 丝裂霉素-C的影响:饲养层细胞需要用到丝裂霉素-C,该物质可能会影响干细胞的增殖。

4, 异种抗原及污染的影响:饲养层细胞作为异种抗原会影响干细胞的健康,还有发生细胞间融,引入其他动物源性病原体,给临床移植治疗带来风险。

5, 所用试剂复杂,批次不可控:所用材料的批次之间的波动,限制了培养物之间的可重复性。

6, 实验周期长,培养基配制复杂:现在市场上有多种多样的干细胞培养基可供选择,大多数都是在基础培养基的基础上,添加例如白血病抑制因子(LIF[6]这样的多功能细胞因子,但无论进口还是国产的产品,都不免有价格高昂的缺点。而自己配制,又会面临操作繁琐,易污染等问题。而且饲养层培养发从培养饲养细胞开始,至少需要一周时间才能得到所需的干细胞,周期过长。

 

二,无饲养层培养

无饲养层培养类似普通细胞培养,主要分为以下几个步骤:培养瓶预处理,配制培养基,消化干细胞,接种,培养。


相较于饲养层培养法,无饲养层培养法的优点显而易见:更加简便,节省时间;但缺点也十分明显:

1, 培养的细胞质量不稳定:由于自行配制的培养基,不可控因素较多,缺少营养细胞对的存在,干细胞生长状况也不稳定,直接影响实验结果。

2, 成本高昂:商品化的培养基,根据品质不同,价格也是从几百元到几千元不等,直接增加了干细胞的培养成本。

3, 需要不断对培养基进行调整,对实验人员有很高的要求:无饲养层培养法需要人为添加各种各样的细胞因子,不同的干细胞还需要进行细微的调整以适应不同的生长需求,因此培养难度更高,对技术人员的操作水平及经验有很高的要求


三,干细胞完全培养基培养法

我们都知道一直以来,干细胞的培养方法被饲养层培养法和无饲养层培养法所“统治“,近日,一项新技术——干细胞完全培养基培养法问世!这项重大突破,兼顾了上述两种培养法的优点又巧妙规避了它们的致命缺点,大大降低了干细胞培养的技术门槛!

 

干细胞完全培养基是一种真正意义上的全新干细胞培养技术!在含微量胎牛血清的基础培养基中,通过添加一种人永生化干细胞系的条件培养基混合组成。干细胞完全培养基含有多种促进细胞增殖的生长因子,如表皮生长因子(EGF),成纤维细胞生长因子(FGF),神经细胞生长因子(NGF),肝细胞生长因子(HGF),脑源性神经营养因子(BDNF),血小板衍生生长因子(PDGF),血管内皮生长因子(VEGF),转化生长因子(TGF)及干细胞分化抑制因子等。因此,干细胞完全培养基具有促进干细胞增殖,抑制干细胞分化及维持干细胞表型,增加干细胞的传代次数的作用,可广泛应用于人及动物的胚胎干细胞,间充质干细胞及各种组织来源的成体干细胞的培养。

 

由于人永生化干细胞系的使用,使得干细胞完全培养基无需额外添加细胞因子或其他人工合成促生长成分,因此,相较于其他商品化的干细胞培养基,干细胞培养Kit,无血清培养基,血清替代物 (SR) 非条件培养基等产品,用干细胞完全培养基进行实验,成本相对更低,但效果却是更上一层楼。

 

纵观整个干细胞培养基市场,能同时满足以上几个条件的产品可以说是凤毛麟角。而Ausbian干细胞完全培养基则是其中的优秀代表,让实验者可以轻松上手,各种干细胞培养都变得小菜一碟!

 


 

 

首先,Ausbian干细胞完全培养基拥有独家技术,使得培养基本身就含有丰富的细胞因子,其中包含了所有含有促进干细胞生长和抑制干细胞分化的各种因子,因此能够有效维持干细胞的干性,抑制干细胞的分化。

 

其次,无需额外添加和二次配制,更省去了体现制备饲养层的复杂操作,根据细胞生长情况每2-3天更换一次培养基。这在无形之中减少了细胞培养的实验步骤,熟悉细胞实验的小伙伴应该都知道,实验步骤越简洁,不可控因素也就越少,实验出错的概率也会更低,因此,使用干细胞完全培养,使实验更简单,可以大大缩短时间成本培养的干细胞品质更稳定,对实验人员技术要求也更低,节省人力成本,轻轻松松让干细胞茁壮成长。

 

不仅如此,因为少了饲养细胞的干扰,也没有丝裂霉素-C等物质的添加,所以用Ausbian干细胞完全培养基能够收获纯度更高,遗传物质更稳定的干细胞。

 

在培养细胞有效性方面,许多科研人员对其进行了评估:培养间充质干细胞可以细胞传代次数8-10次,培养成体干细胞可以使细胞的增殖速率增加300%,实验数据真实可靠。

 

1. 人成体干细胞(3代)增殖实验:CCK8分析

干细胞培养基 对比 Ausbian干细胞专用培养基(细胞培养72小时)

接种细胞密度

培养基种类

A组(低)

B组(中)

  C组(高)

干细胞培养基(白色)

0.09±0.01

0.19±0.07

0.35±0.10

Ausbian干细胞培养基(黑色)

0.13±0.01

0.50±0.05

1.22±0.16


 

 

2. 人间充质干细胞(3代)增殖实验:CCK8分析

a-MEM,干细胞培养基 对比 Ausbian干细胞专用培养基

细胞培养时间

培养基种类

1

4

7

10

a-MEM

0.27±0.01

0.31±0.02

0.42±0.03

0.48±0.05

干细胞培养基(白色)

0.31±0.01

0.36±0.04

0.46±0.02

0.57±0.02

Ausbian干细胞培养基(黑色)

0.33±0.03

0.45±0.03

0.64±0.04

0.99±0.05


 

 

3.细胞传代次数:

培养基种类

细胞类型

a-MEM

干细胞培养基

Ausbian干细胞

专用培养基

人成体干细胞

4

4

8-10

人间充质干细胞

5

4

8-10次

 

Ausbian干细胞完全培养基另外一项革命性的突破在于,可广泛应用于人及动物的胚胎干细胞,间充质干细胞及各种组织来源的成体干细胞的培养,省去了更换细胞时反复调试培养基的繁琐步骤,极高的普适性进一步降低了人力,物力以及时间成本。

 

说完有效性再来看看安全性。Ausbian干细胞完全培养基均经过严格的质量检验,无论是支原体还是衣原体检测均为阴性,无农药污染及重金属超标,同时还进行了放射性照射,确保培养基无任何病原体及病毒污染,确保内毒素极低,为干细胞提供一个安全健康的生长环境。

 

最后要说明的是,Ausbian干细胞完全培养基是我国的科学家自主研发的,其中制备的永生化人干细胞系为具有独特性,制备产品所使用的永生化人干细胞系国内同类产品,货源充足,供货稳定供货周期短,保证干细胞生长过程中不会出现“断粮”的情况,让实验者更安心!

 

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http://www.kusemodel.com/c123878/products/d11549512.html

 

参考文献:

1. 裴雪涛.干细胞生物学:科学出版社,20034-15

2. 吴静,胡东,张荣波.胚胎干细胞培养方法研究进展[J].广东医学,2010,31(01):116-118.

3. J.A. Burdick, G. Vunjak-Novakovic Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation Tissue Eng. Part A, 15 (2009), pp. 205-219

4. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981 Jul 9;292(5819):154-6. doi: 10.1038/292154a0. PMID: 7242681.

5. 田小利,陈兰英,扈莱良. 1994. 转基因方法:胚胎干细胞法. 转基因动物原理,技术与应用. 吉林科技出版社, 2632

6. Williams RL, Hilton DJ, Pease S. 1988. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature, 336: 684687

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